Există sute de metode diferite de determinare a concentrației de proteine. Diversitatea incredibilă a tipurilor de soluții de proteine pe care biochimiștii le analizează este motivul pentru care nu există o metodă universală unică care să funcționeze pentru fiecare tip de soluție de proteine. Cele mai comune teste de proteine sunt testul Bradford, testul Lowry și testul acidului bicinconinic. Cu toate acestea, au fost dezvoltate nenumărate variații după cum este necesar pentru a rezolva orice potențiale incompatibilități chimice între soluția de proteine și reactivii care sunt utilizați în test.
În general, există două categorii principale de teste pentru determinarea concentrației de proteine. În primul grup de metode, la o soluție de proteine se adaugă un colorant colorat sau fluorescent și se leagă în mod specific de proteine. Colorantul legat are o lungime de undă unică de absorbție care este proporțională cu cantitatea de proteină. Prin utilizarea unui spectrometru, devine posibilă estimarea concentrației de proteine.
Al doilea grup de teste implică adăugarea de ioni de cupru (II) la o soluție de proteină, unde acești ioni sunt reduși la ioni de cupru (I). Acești ioni redusi sunt apoi capabili să formeze complexe colorate prin legarea de proteine. Măsurând absorbanțele la lungimile de undă unice ale acestora, concentrațiile de proteine pot fi, de asemenea, deduse.
Una dintre cele mai populare metode de determinare a concentrației de proteine este testul Bradford. În acest test, un colorant roșu numit Coomassie Brilliant Blue este adăugat la o soluție de proteine în condiții acide. Pe măsură ce acest colorant se leagă de proteine, formează un complex albastru permanent cu o absorbanță caracteristică la 595 nanometri.
În ciuda versatilității generale a testului Bradford, acesta este incompatibil cu unele soluții de proteine. În special, testul Bradford este perturbat de prezența dodecil sulfatului de sodiu (SDS), un detergent care este utilizat în mod obișnuit pentru a purifica proteinele și a descompune celulele prin liză. Acest detergent interferează cu legarea colorantului de proteine, ceea ce are ca rezultat o citire nesigură și inexactă a absorbției. Alte tipuri de metode, atunci, trebuie utilizate atunci când SDS este prezent.
A fost dezvoltată o altă serie de teste de proteine și toate implică o variație a testului Biuret. În această reacție, o proteină este combinată cu o bază apoasă și cu ioni de cupru (II). Acești ioni sunt reduși și apoi chelați de proteine pentru a forma complexe colorate. Două teste care utilizează acest test sunt testul Lowry și testul acidului bicinchoninic.
Cu testul Lowry, se adaugă un reactiv Folin-Ciocalteu la testul Biuret. Reactivul Folin-Ciocalteu oxidează reziduurile aromatice, în special triptofanul, și ajută la absorbția puternică a complexului la 750 de nanometri. Analiza acidului bicinconinic, pe de altă parte, implică adăugarea acidului bicinconinic la testul Biuret. După o scurtă incubare la aproximativ 104° Fahrenheit (40° Celsius), doi echivalenți de acid și legăturile peptidice ale proteinei chelează un singur ion de cupru (I). Rezultatul este un complex care se absoarbe puternic la 562 de nanometri.
Atunci când se selectează o metodă pentru determinarea concentrației de proteine, este important să se ia în considerare diferitele grupe funcționale chimice prezente în soluție. Prezența anumitor lanțuri laterale de aminoacizi, legături disulfurice și cofactori poate face determinarea concentrației de proteine extrem de inexacte. Este adesea necesar ca cineva să ia în considerare nu numai proteinele, ci și alți reactivi și tampoane, cum ar fi agenți reducători și detergenți. Metoda ideală va fi compatibilă chimic, precum și fiabilă, ieftină și simplu de configurat.