Citometria în flux este studiul celulelor individuale pe măsură ce trec printr-un flux lichid. Componentele celulei, fie intern, fie la suprafață, trebuie mai întâi marcate cu unul sau mai mulți coloranți fluorescenți. Un laser din interiorul unui instrument numit citometru de flux excită aceste molecule fluorescente astfel încât să emită lumină la diferite lungimi de undă. Cantitatea de fluorescență poate da o indicație cu privire la ce procent din diferite tipuri de celule sunt prezente în probă. Citometria în flux este utilizată în laboratoare pentru o varietate de aplicații, inclusiv cercetarea cancerului, imunologie și analiza ciclului celular.
Pentru a efectua analiza citometriei în flux, o suspensie de celule individuale trebuie colorată cu coloranți fluorescenți, care se poate face fie într-un proces într-o etapă, fie în două etape. Proteinele celulare sunt adesea colorate folosind anticorpi direcționați împotriva proteinei de interes. Un proces într-o singură etapă implică colorarea celulelor cu anticorpi care sunt deja marcați cu colorant fluorescent. Dacă anticorpii marcați nu sunt disponibili, celulele pot fi colorate mai întâi cu un anticorp primar nemarcat și apoi cu un anticorp secundar marcat fluorescent.
Odată ce celulele sunt etichetate, acestea sunt gata pentru analiza citometriei în flux. Un tub care conține suspensie de celule este încărcat pe citometrul de flux. Celulele curg prin instrument și trec în fața unui laser într-o singură pilă. Pe măsură ce laserul lovește fiecare celulă, lumina este împrăștiată într-o direcție înainte sau laterală. Măsurătorile de împrăștiere înainte oferă o indicație a dimensiunii celulei, în timp ce împrăștierea laterală este o măsură a granularității celulelor.
Energia de la laser excită, de asemenea, moleculele de fluorocrom, colorantul fluorescent folosit pentru a colora celulele. Un laser comun utilizat pentru citometria în flux este laserul cu ioni de argon care emite lumină la o lungime de undă de 488 nanometri (nm). Această lumină excită moleculele colorantului verde fluoresceină, care apoi emite lumină la o lungime de undă de 525 nm. Tuburile fotomultiplicatoare (PMT) din citometrul de flux au filtre de lumină care detectează lumina emisă de diverșii fluorocromi. Instrumentul poate avea mai multe PMT care detectează lumina la diferite lungimi de undă.
Dioda roșie, dioda violetă sau He-Ne (heliu-neon) sunt alte lasere care pot fi utilizate într-un citometru de flux. Alți fluorocromi utilizați în analiza citometriei în flux includ ficoeritrina, roșu Texas sau aloficocianina. Combinațiile diferite de lasere și fluorocromi permit cercetătorului să colecteze informații despre mulți markeri celulari diferiți în același experiment.
Software-ul conceput pentru a fi utilizat cu citometrul de flux ajută cercetătorul să vizualizeze datele. Populațiile de celule sunt analizate folosind diagrame cu puncte, diagrame de densitate sau histograme. Regiunile pot fi desenate în jurul celulelor de interes și intensitatea fluorescenței poate oferi o indicație a procentelor diferitelor celule din probă.