Protocolul Western blot este standardele exacte după care se efectuează testul imunoblot. Western blot este utilizat pentru a detecta proteinele dintr-o probă de țesut. Procesul separă proteinele native prin determinarea lungimii polipeptidelor folosind o electroforeză pe gel. Proteinele în sine sunt apoi transferate pe o membrană de nitroceluloză și testate de anticorpi.
Prima parte a protocolului Western blot începe cu colectarea de țesut. Aceste probe sunt colectate fie din țesut viu, fie dintr-o cultură celulară. Țesutul este descompus și diverși inhibitori precum proteaza sau fosfataza sunt introduși pentru a împiedica enzimele să efectueze digestia. Această parte a protocolului este de obicei manipulată la temperaturi scăzute pentru a păstra țesuturile.
Procesul de electroforeză pe gel este următorul pas în protocolul Western blot. În această porțiune, proteinele sunt identificate prin diverși factori, cum ar fi greutatea moleculară sau sarcina electrică. Acest proces este finalizat cel mai frecvent folosind geluri de poliacrilamidă cu un tampon de dodecil sulfat de sodiu. Practic, proteinele devin încărcate negativ și se deplasează către un electrod încărcat pozitiv în gel.
Transferul proteinelor este următoarea parte a procesului general de western blot. O membrană este plasată deasupra gelului, urmată de hârtie de filtru. Pe măsură ce se administrează un curent electric, proteinele sunt atrase în membrană. Aceasta este denumită porțiunea reală de „blotting” a analizei. Membranele sunt foarte fragile și ușor susceptibile la deteriorare.
Fluxul corect al protocolului western blot necesită pasul cunoscut sub numele de legare. Pentru a preveni contaminarea proteinelor în sine de către anticorpii care trebuie adăugați, trebuie implementat un fel de ecranare. Cel mai comun tip de blocare folosește lapte uscat fără grăsimi și un detergent. Aceasta se leagă de punctele deschise din membrană și permite rezultate mai clare atunci când se adaugă anticorpul.
Detectarea este următorul pas conform protocolului corect. Proteinele sunt introduse în anticorpi care au fost legați de o enzimă specifică care va oferi cercetătorilor informațiile dorite. Anticorpul este incubat cu membrana timp de 30 de minute sau mai mult. Ulterior, membrana este spălată și este introdus un anticorp secundar care se leagă de primul. Adesea, un agent luminiscent este folosit pentru a ajuta oamenii de știință în procesul de identificare.
Materialul este spălat din nou pentru a îndepărta orice articole nelegate. Analiza dimensiunii benzilor colorate dezvăluie informații cu privire la proeminența și amploarea unei anumite proteine. Acest lucru este, în general, completat de câteva ori pentru a asigura o analiză adecvată. Opțiunile de detectare includ raze X, coloranți și substanțe chimice.