Secvențierea cu pușcă este o metodă de secvențiere a ADN-ului prin care o întindere lungă de ADN este ruptă fizic în fragmente mici (aproximativ 2,000 de perechi de baze) care sunt clonate, secvențiate și asamblate folosind analiza computerizată. A fost dezvoltat și făcut celebru de Craig Venter de la Celera Corporation. Venter a dezvoltat tehnica în 1996 în timp ce lucra la Institutul de Cercetare a Genomului.
Venter a fondat Celera în 1998 cu misiunea de a secvenția genomul uman în trei ani. Acest obiectiv a fost în competiție directă cu Human Genome Project, un consorțiu de universități care lucrează împreună pentru a secvenția genomul uman folosind o strategie mai veche numită secvențiere bazată pe hărți sau BAC-to-BAC. Această metodă a implicat mai întâi ruperea genomului în 150,000 de bucăți de perechi de baze numite BAC, asamblarea BAC-urilor în ordine și apoi secvențierea fiecărui BAC în detaliu.
Secvențierea genomului întreg ocolește crearea și maparea BAC-urilor și începe chiar cu secvențierea ADN-ului. Procesul începe cu obținerea unui eșantion de ADN cu greutate moleculară mare din organismul de interes și ruperea fizică a acesteia în bucăți mici, trecând printr-o seringă de ecartament îngust sau supunând-o, o modalitate de a sparge proba folosind unde sonore. Forfecarea este un proces aleatoriu, astfel încât secvențele fragmentelor vor avea o oarecare suprapunere între ele. Forfecarea nu creează în mod specific fragmentele de 2,000 de perechi de baze necesare pentru secvențiere, mai degrabă fragmentele de dimensiunea dorită trebuie purificate din amestec.
Următorul pas este unirea fragmentelor de ADN cu ADN purtător numit vector. Acest proces este cunoscut sub numele de clonare și creează o bibliotecă de secvențiere din care se va crea secvența unui întreg genom. Se determină secvența fiecărei clone din bibliotecă și se utilizează analiza computerizată pentru a găsi secvențe suprapuse sau continue în fiecare fragment. Asamblarea suprapunerilor creează un „contig”, care este o întindere lungă și continuă a secvenței ADN.
Clonarea puștilor va avea ca rezultat, de obicei, unele lacune între contig, deoarece unele secvențe lipsesc din bibliotecă din întâmplare. Golurile pot fi umplute făcând o nouă bibliotecă sau folosind secvențe cunoscute pentru a se extinde în exterior din contig. Deoarece secvențierea cu pușcă secvențiază fragmentele de ADN la întâmplare, multe fragmente sunt secvențiate de mai multe ori, creând o mai mare siguranță că secvența este corectă decât dacă fiecare fragment ar fi fost secvențiat doar o dată sau de două ori.
Genomul uman a fost secvențiat atât de Human Genome Project folosind secvențierea bazată pe hărți, cât și de Celera folosind secvențierea pușcă. Secvențierea cu pușcă este acum metoda preferată pentru alte tipuri de secvențiere a genomului. Genomul complet al multor organisme, cum ar fi planta Arabidopsis thaliana, orezul, vaca, câinele, puiul, cimpanzeul, șobolanul, șoarecele, peștele puf și multe microorganisme au fost secvențiați în acest fel.