Οι κουκουβάγιες παίζουν σημαντικό ρόλο στη μυθολογία πολλών πολιτισμών σε όλο τον κόσμο. Στη μυθολογία, μπορεί να είναι σύντροφοι των θεών, κακά πνεύματα, σοφοί παρατηρητές ή ενσάρκωση φυσικών δυνάμεων. Σε πολλούς πολιτισμούς, οι κουκουβάγιες είναι αγγελιοφόροι του θανάτου ή συνδέονται με άλλο τρόπο με τις δυνάμεις του κάτω κόσμου. Αυτή η αρνητική χροιά προκύπτει από το γεγονός ότι οι κουκουβάγιες είναι νυκτόβιες. Τα ζώα που δραστηριοποιούνται τη νύχτα έχουν συχνά αρνητικούς ρόλους στο μύθο και τη λαογραφία.
Οι πιο διάσημες κουκουβάγιες στη μυθολογία είναι πιθανώς αυτές που συνδέονται με την Αθηνά, την ελληνική θεά της σοφίας και του πολέμου, προστάτιδα θεότητα της πόλης των Αθηνών. Καλλιτέχνες απεικόνισαν την Αθηνά με μια κουκουβάγια στον έναν ώμο. Οι κουκουβάγιες μπορεί να είχαν συνδεθεί με τη θεά λόγω της ικανότητάς τους να βλέπουν καλά τη νύχτα και των μεγάλων ματιών τους, που προκαλούσαν το επίθετό της, «λαμπερή Αθηνά». Ως αποτέλεσμα αυτής της συσχέτισης, οι κουκουβάγιες συνεχίζουν να είναι σύμβολα σοφίας στον δυτικό κόσμο. Ένα γένος κουκουβάγιων διατηρεί το όνομα «Athene».
Η μυθολογία από άλλα μέρη του κόσμου συχνά δίνει στις κουκουβάγιες έναν πιο απαίσιο ρόλο. Αν και οι Ρωμαίοι υιοθέτησαν πολλά στοιχεία της ελληνικής θρησκείας, η ρωμαϊκή λαογραφία παρουσίαζε επίσης επικίνδυνα πλάσματα που έμοιαζαν με κουκουβάγια που μπορούσαν να απομυζήσουν τη ζωτική δύναμη ενός βρέφους. Ομοίως, στην αραβική μυθολογία, οι κουκουβάγιες ήταν πτηνά κακού οιωνού. Ο θρύλος έλεγε ότι οι κουκουβάγιες θα κουνούσαν πάνω από τους τάφους των δολοφονημένων ανδρών και τα αυγά τους θεωρήθηκε ότι είχαν υπερφυσικές ιδιότητες. Παρόμοιες πεποιθήσεις είναι γνωστό ότι υπάρχουν ή έχουν υπάρξει στην υποσαχάρια Αφρική, όπου οι κουκουβάγιες παίζουν το ρόλο των προάγγελων του θανάτου ή των φερόντων κακοτυχίας.
Στη Νότια και Κεντρική Αμερική, οι κουκουβάγιες συνδέονται ξανά με τον θάνατο και τον κάτω κόσμο. Στη μυθολογία των Μάγια, ο Xibalba, «ο τόπος του φόβου», κυβερνάται από δύο θεούς του θανάτου, τον Hun-Came («Ένας θάνατος») και τον Vucub-Came («Επτά θάνατοι»). Οι αγγελιοφόροι τους είναι τέσσερα πνεύματα που παίρνουν σχήμα κουκουβάγιας. Ομοίως, ο θεός των Αζτέκων Mictlantecuhtli, ο θεός των νεκρών, εμφανίζεται ως σκελετός που φοράει κόμμωση από φτερά κουκουβάγιας.
Τα ιθαγενή έθνη της Βόρειας Αμερικής είχαν μια μεγάλη ποικιλία διαφορετικών ρόλων για τις κουκουβάγιες στη μυθολογία τους. Σε ορισμένους πολιτισμούς, η κουκουβάγια έπαιζε το ρόλο ενός αγγελιοφόρου από τον κάτω κόσμο, ενώ σε άλλους, όπως οι Σιού, ήταν φύλακας που προστάτευε την είσοδο στη μετά θάνατον ζωή. Το έθνος Passamaquoddy είπε μια ιστορία στην οποία το πουλί ήταν ένα βοηθητικό πνεύμα που παρείχε στους ανθρώπους μαγικά δώρα.