Το φασματοφωτόμετρο είναι ένα από τα επιστημονικά όργανα που βρίσκονται συνήθως σε πολλά ερευνητικά και βιομηχανικά εργαστήρια. Τα φασματοφωτόμετρα χρησιμοποιούνται για έρευνα σε εργαστήρια φυσικής, μοριακής βιολογίας, χημείας και βιοχημείας. Συνήθως, το όνομα αναφέρεται σε φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατής (UV-Vis).
Η ενέργεια του φωτός εξαρτάται από το μήκος κύματός του, που συνήθως ορίζεται ως λάμδα. Αν και το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα εκτείνεται σε ένα τεράστιο εύρος μηκών κύματος, τα περισσότερα εργαστήρια μπορούν να μετρήσουν μόνο ένα μικρό κλάσμα από αυτά. Η φασματοσκοπία UV-Vis μετρά μεταξύ 200 και 400 νανόμετρα (nm) για μετρήσεις υπεριώδους φωτός και έως περίπου 750 nm στο ορατό φάσμα.
Για τη φασματοσκοπία UV-Vis, τα δείγματα συνήθως περιέχονται και μετρώνται σε μικρά δοχεία που ονομάζονται κυβέτες. Αυτά μπορεί να είναι πλαστικά εάν χρησιμοποιούνται στο ορατό φάσμα, αλλά πρέπει να είναι χαλαζία ή λιωμένο πυρίτιο εάν χρησιμοποιούνται για μετρήσεις υπεριώδους ακτινοβολίας. Υπάρχουν ορισμένα μηχανήματα που μπορούν να χρησιμοποιήσουν γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες.
Η Ορατή Φασματοσκοπία χρησιμοποιείται συχνά βιομηχανικά για τη χρωματομετρία. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, τα δείγματα μετρώνται σε πολλαπλά μήκη κύματος από 400-700 nm και τα προφίλ απορρόφησής τους συγκρίνονται με ένα πρότυπο. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται συχνά από κατασκευαστές κλωστοϋφαντουργικών προϊόντων και μελανιών. Άλλοι εμπορικοί χρήστες της φασματοσκοπίας UV-Vis περιλαμβάνουν εγκληματολογικά εργαστήρια και εκτυπωτές.
Στη βιολογική και χημική έρευνα, τα διαλύματα συχνά ποσοτικοποιούνται με μέτρηση του βαθμού απορρόφησης φωτός σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος. Για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης της ένωσης χρησιμοποιείται μια τιμή που ονομάζεται συντελεστής εξάλειψης. Για παράδειγμα, τα εργαστήρια μοριακής βιολογίας χρησιμοποιούν φασματοφωτόμετρα για να μετρήσουν τις συγκεντρώσεις δειγμάτων DNA ή RNA. Μερικές φορές έχουν ένα προηγμένο μηχάνημα που ονομάζεται φασματοφωτόμετρο NanoDrop™ που χρησιμοποιεί ένα κλάσμα της ποσότητας του δείγματος σε σύγκριση με αυτό που χρησιμοποιείται από τα παραδοσιακά φασματοφωτόμετρα.
Για να είναι έγκυρη η ποσοτικοποίηση, το δείγμα πρέπει να συμμορφώνεται με τον νόμο Beer-Lambert. Αυτό απαιτεί η απορρόφηση να είναι ευθέως ανάλογη με το μήκος διαδρομής της κυψελίδας και την απορρόφηση της ένωσης. Υπάρχουν διαθέσιμοι πίνακες συντελεστών εξαφάνισης για πολλές, αλλά όχι όλες, ενώσεις.
Πολλές χημικές και ενζυμικές αντιδράσεις αλλάζουν χρώμα με την πάροδο του χρόνου και τα φασματοφωτόμετρα είναι πολύ χρήσιμα για τη μέτρηση αυτών των αλλαγών. Για παράδειγμα, τα ένζυμα οξειδάσης πολυφαινόλης που προκαλούν καφέ χρώμα στα φρούτα οξειδώνουν διαλύματα φαινολικών ενώσεων, αλλάζοντας τα διαυγή διαλύματα σε αυτά που είναι ορατά χρωματισμένα. Τέτοιες αντιδράσεις μπορούν να προσδιοριστούν μετρώντας την αύξηση της απορρόφησης καθώς αλλάζει το χρώμα. Στην ιδανική περίπτωση, ο ρυθμός μεταβολής θα είναι γραμμικός και μπορεί κανείς να υπολογίσει τα ποσοστά από αυτά τα δεδομένα. Ένα πιο προηγμένο φασματοφωτόμετρο θα έχει μια βάση ελεγχόμενης θερμοκρασίας για τη διεξαγωγή των αντιδράσεων σε μια ακριβή θερμοκρασία ιδανική για το ένζυμο.
Τα εργαστήρια μικροβιολογίας και μοριακής βιολογίας χρησιμοποιούν συχνά ένα φασματοφωτόμετρο για τη μέτρηση της ανάπτυξης των καλλιεργειών βακτηρίων. Τα πειράματα κλωνοποίησης DNA γίνονται συχνά σε βακτήρια και οι ερευνητές πρέπει να μετρήσουν το στάδιο ανάπτυξης της καλλιέργειας για να γνωρίζουν πότε πρέπει να πραγματοποιήσουν ορισμένες διαδικασίες. Μετρούν την απορρόφηση, η οποία είναι γνωστή ως οπτική πυκνότητα (OD), σε ένα φασματοφωτόμετρο. Μπορεί κανείς να πει από το OD εάν τα βακτήρια διαιρούνται ενεργά ή αν αρχίζουν να πεθαίνουν.
Τα φασματοφωτόμετρα χρησιμοποιούν μια πηγή φωτός για να ακτινοβολούν μια σειρά μηκών κύματος μέσω ενός μονοχρωμάτορα. Αυτή η συσκευή μεταδίδει στη συνέχεια μια στενή ζώνη φωτός και το φασματοφωτόμετρο συγκρίνει την ένταση φωτός που διέρχεται από το δείγμα με εκείνη που διέρχεται από μια ένωση αναφοράς. Για παράδειγμα, εάν μια ένωση διαλύεται σε αιθανόλη, η αναφορά θα είναι η αιθανόλη. Το αποτέλεσμα εμφανίζεται ως ο βαθμός απορρόφησης της διαφοράς μεταξύ τους. Αυτό δείχνει την απορρόφηση της ένωσης του δείγματος.
Ο λόγος για αυτήν την απορρόφηση είναι ότι τόσο το υπεριώδες όσο και το ορατό φως έχουν αρκετή ενέργεια για να διεγείρουν τις χημικές ουσίες σε μεγαλύτερα επίπεδα ενέργειας. Αυτή η διέγερση έχει ως αποτέλεσμα ένα υψηλότερο μήκος κύματος, το οποίο είναι ορατό όταν η απορρόφηση σχεδιάζεται σε σχέση με το μήκος κύματος. Διαφορετικά μόρια ή ανόργανες ενώσεις απορροφούν ενέργεια σε διαφορετικά μήκη κύματος. Αυτά με μέγιστη απορρόφηση στο ορατό εύρος φαίνονται χρωματισμένα από το ανθρώπινο μάτι.
Τα διαλύματα των ενώσεων μπορεί να είναι διαυγή, αλλά απορροφώνται στην περιοχή UV. Τέτοιες ενώσεις έχουν συνήθως διπλούς δεσμούς ή αρωματικούς δακτυλίους. Μερικές φορές υπάρχουν μία ή περισσότερες ανιχνεύσιμες κορυφές όταν ο βαθμός απορρόφησης σχεδιάζεται σε σχέση με το μήκος κύματος. Εάν ναι, αυτό μπορεί να βοηθήσει στην ταυτοποίηση ορισμένων ενώσεων συγκρίνοντας το σχήμα της γραφικής παράστασης με αυτό των γνωστών διαγραμμάτων αναφοράς.
Υπάρχουν δύο τύποι μηχανών φασματοφωτόμετρου UV-Vis, μονής δέσμης και διπλής δέσμης. Αυτά διαφέρουν ως προς τον τρόπο με τον οποίο μετρούν την ένταση φωτός μεταξύ του δείγματος αναφοράς και του δείγματος δοκιμής. Οι μηχανές διπλής δέσμης μετρούν την ένωση αναφοράς και την ένωση δοκιμής ταυτόχρονα, ενώ οι μηχανές μονής δέσμης μετρούν πριν και μετά την προσθήκη της ένωσης δοκιμής.