W laboratoriach kryminalistycznych próbki DNA czasami docierają w postaci zdegradowanej i do testowania pozostaje niewiele żywotnego materiału. Analiza mitochondrialnego DNA polega na analizie DNA obecnego w mitochondriach komórki, a nie DNA jądrowego, do którego zaprojektowano większość testów. Ta technika może dostarczyć wyników dowodowych, a także ujawnić rodowód poprzez linię matczyną osoby lub gatunku.
Jądrowy DNA znajduje się tylko w jądrze komórkowym, po jednej kopii od ojca i matki. Mitochondria wytwarzają energię w komórkach i są obecne w dużych ilościach. W próbkach ze zdegradowanym lub nieobecnym jądrowym DNA, większa ilość mitochondrialnego DNA (mtDNA) oznacza, że nadal można przeprowadzić badanie. Włosy, kości i zęby są dobrymi kandydatami do analizy mitochondrialnego DNA. W przypadku, gdy większość ciała uległa rozkładowi lub być może spalona, często pozostają tylko kości i zęby.
Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) i krótkich powtórzeń tandemowych (STR), najczęściej wykonywanych, tylko testuje jądrowe DNA. MtDNA jest nie tylko bardziej obfite, ale jest również przenoszone głębiej w komórkach, więc jest mniej prawdopodobne, że zostanie zniszczony, gdy komórka jest zagrożona. Nie ulega degradacji, nawet gdy próbka jest stara. To sprawia, że analiza mitochondrialnego DNA jest niezwykle cennym narzędziem w rozwiązywaniu zimnych przypadków.
Badania rozpoczynają się od pobrania i udokumentowania próbki. Zdjęcia są robione, ponieważ proces ten niszczy materiał. Po zakończeniu kontroli wizualnej próbka jest dokładnie czyszczona w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń, które mogą mieć wpływ na wyniki. Próbka zostanie następnie przetworzona w celu utworzenia wielu kopii DNA, które można przeanalizować i porównać z kontrolą.
Wszystkie osoby spokrewnione matczynie, takie jak rodzeństwo, które ma tę samą matkę, będą miały dokładnie to samo mtDNA, chociaż analiza nie może rozróżnić osób. Jest często stosowany w przypadkach osób zaginionych lub przy odkryciu niezidentyfikowanych szczątków, ponieważ krewny matek, który przeżył, może dostarczyć próbki porównawczej. Analiza mitochondrialnego DNA może być również przeprowadzona na zwierzęcym DNA i pomaga naukowcom śledzić gatunki na przestrzeni pokoleń.
Analiza mitochondrialnego DNA została wykorzystana do zidentyfikowania szczątków amerykańskiego wyjętego spod prawa Jesse Jamesa, a także carycy Aleksandry Fiodorownej Romanowej i jej dzieci. Ana Anderson, kobieta twierdząca, że jest córką cesarzowej Anastazją, która przeżyła rodzinną egzekucję, została zdyskredytowana po tym, jak mtDNA pokazało jej, że jest Polką o nazwisku Franzisca Schonzkowska. Analiza tkanki z zachowanego serca dziecka rzekomo syna Marii Antoniny, Ludwika Karola, który zmarł w więzieniu podczas rewolucji francuskiej, oraz mtDNA z włosów królowej wykazały, że dziecko było najprawdopodobniej nieszczęsnym księciem.