Το επίπεδο φωσφορυλίωσης των οργανικών μορίων ή ουσιών προσδιορίζεται με δύο μεθόδους: western blotting και φασματομετρία μάζας. Η φωσφορυλίωση αναφέρεται συχνότερα στη σύνδεση ενός φωσφορικού άλατος σε πρωτεΐνη. Όταν τα φωσφορικά άλατα προσκολλώνται σε πρωτεΐνες, διαταράσσονται οι φυσικές διεργασίες και οι λειτουργίες των πρωτεϊνικών ενζύμων στο ανθρώπινο σώμα. Ο προσδιορισμός του επιπέδου φωσφορυλίωσης είναι ζωτικής σημασίας για τη θεραπεία ενός ευρέος φάσματος ασθενειών, από τον καρκίνο έως τον διαβήτη.
Το Western blotting είναι μια δημοφιλής μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του επιπέδου φωσφορυλίωσης ενός συγκεκριμένου συνόλου πρωτεϊνών. Αντισώματα όπως τα μονοκλωνικά αντισώματα κατά της φωσφο-τυροσίνης χρησιμοποιούνται συνήθως επειδή συνδέονται εύκολα με τα υπολείμματα τυροσίνης μιας πρωτεΐνης, τα οποία επηρεάζονται από τη φωσφορυλίωση. Στο western blotting, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται πρώτα κατά μέγεθος χρησιμοποιώντας μια μέθοδο ηλεκτρικού φορτίου γνωστή ως ηλεκτροφόρηση γέλης.
Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρονται σε μια μεμβράνη που έχει καλυφθεί με ειδικά αντισώματα που συνδέονται με φωσφορικά άλατα στις πρωτεΐνες. Μόλις μεταφερθούν οι πρωτεΐνες, τα αντισώματα θα κολλήσουν σε οποιεσδήποτε πρωτεΐνες με προσκολλημένο φωσφορικό άλας. Το επίπεδο φωσφορυλίωσης μπορεί στη συνέχεια να προσδιοριστεί με ακτινογραφία της μεμβράνης. Οποιεσδήποτε επηρεασμένες πρωτεΐνες θα εκπέμψουν μια λάμψη φωτός, καθιστώντας ευκολότερο για τον ερευνητή να μετρήσει τα επίπεδα φωσφορυλίωσης.
Η φασματομετρία μάζας είναι ένας άλλος τρόπος μέτρησης του επιπέδου φωσφορυλίωσης μιας ουσίας. Αυτή η διαδικασία μετατρέπει τα μόρια πρωτεΐνης σε ιόντα, γεγονός που καθιστά ευκολότερη την παρακολούθηση και τη μέτρησή τους. Το δείγμα ιονίζεται από μια πηγή ιόντων υψηλής ισχύος που κατακλύζει το δείγμα με ηλεκτρόνια. Αυτή η δράση μετατρέπει το δείγμα σε κατιόντα, θετικά φορτισμένα ιόντα.
Ο αναλυτής μάζας του φασματόμετρου μάζας διαχωρίζει τα ιόντα με τη μάζα και την ένταση φορτίου τους. Αυτό επιτρέπει στον ερευνητή να ανακαλύψει την αναλογία μάζας προς φορτίο, η οποία είναι κρίσιμη για την ανακάλυψη του επιπέδου φωσφορυλίωσης του δείγματος. Τέλος, ο ανιχνευτής μετρά τα ιόντα έτσι ώστε τα δεδομένα να εμφανίζονται σε μορφή γραφήματος. Το διάγραμμα δείχνει την αναλογία μάζας προς φορτίο των ιόντων στον άξονα x και τη σχετική ένταση των ιόντων στον άξονα y.
Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης μπορούν επίσης να μετρηθούν κατά τη διάρκεια της φωσφορυλίωσης του υποστρώματος. Η φωσφορυλίωση του υποστρώματος είναι μια διαδικασία που δημιουργεί τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP), ένα μόριο κρίσιμο για τη μεταφορά ενέργειας μεταξύ των κυττάρων, κατά τη διάρκεια της γλυκόλυσης. Αυτή η διαδικασία συμβαίνει τόσο στα ζωικά όσο και στα φυτικά κύτταρα.
Στα φυτικά κύτταρα, τα μόρια ATP δημιουργούνται χρησιμοποιώντας ενέργεια από τον ήλιο. Αυτή η ενέργεια διεγείρει τη φωσφορυλίωση στους χλωροπλάστες του φυτού, τη θέση της φωτοσύνθεσης των φυτών. Το επίπεδο φωσφορυλίωσης συσχετίζεται με την ποσότητα φωσφορικού που απαιτείται για τη δημιουργία πρόσθετων μορίων ATP.