Un microscop confocal este un tip special de microscop fluorescent utilizat pentru a obține imagini 2D și 3D de înaltă calitate. Cu un microscop fluorescent de bază (cu câmp larg), lumina cu o anumită lungime de undă este strălucită pe un specimen, iar specimenul absoarbe o parte din acea lumină și reflectă restul ei la o lungime de undă mai mare. Lumina cu lungime de undă mai mare trece printr-o oglindă dicroică, ceea ce permite luminii cu lungime de undă mai mare, dar nu și luminii cu lungime de undă inițială (mai scurtă). Persoana care vede eșantionul vede doar lumina care a trecut prin oglinda dicroică. Microscoapele fluorescente de bază captează atât lumina focalizată, cât și cea nefocalizată, ceea ce funcționează bine pentru specimenele mari unde nu este necesară o rezoluție foarte mare. Nu funcționează atât de bine pentru vizualizarea detaliilor fine. Este necesar un microscop confocal pentru a captura imagini fluorescente de înaltă rezoluție.
Microscopul confocal folosește un orificiu pentru a respinge lumina nefocalizată. În loc ca lumina să treacă doar printr-o oglindă dicroică, lumina trece atât printr-o oglindă dicroică, cât și printr-un orificiu, ceea ce înseamnă că persoana care vede eșantionul vede doar un singur punct al eșantionului. Pentru a vizualiza un întreg eșantion, oglinzile mobile scanează lumina pe un plan dreptunghiular al probei, iar un computer colectează lumina emisă pe măsură ce specimenul este scanat. O scanare completă va avea ca rezultat o secțiune optică, sau secțiune transversală, a specimenului. Acest tip de microscopie se numește microscopie confocală cu scanare cu laser, în parte pentru că un laser este folosit ca sursă de lumină.
Pentru a crea o imagine 3D, se fac mai multe scanări, creând mai multe „feții” ale specimenului, iar un computer combină fiecare felie pentru a crea o imagine tridimensională. Microscopul poate fi programat pentru a varia spațiul dintre felii, în funcție de cât de clară dorește să obțină o imagine 3D. De asemenea, microscopul poate varia viteza cu care scanează o imagine, scanarea lentă oferind o rezoluție mai mare decât scanarea rapidă.
Microscopul confocal a devenit un echipament foarte frecvent utilizat în multe laboratoare de științe ale vieții. Sunt scumpe, și oarecum mari, și au adesea camere dedicate utilizării lor, deoarece camera trebuie să fie întunecată pentru a obține o imagine fluorescentă bună. Deși microscoapele confocale sunt cel mai frecvent utilizate pentru a vizualiza celulele și structurile din interiorul celulelor, ele pot fi utilizate pentru a obține o imagine a oricărui specimen fluorescent tridimensional și sunt uneori folosite pentru a vizualiza materiale semiconductoare.