Το πρωτόκολλο Western blot είναι τα ακριβή πρότυπα με τα οποία διεξάγεται η δοκιμή ανοσοστύπωσης. Το Western blot χρησιμοποιείται για την ανίχνευση πρωτεϊνών σε δείγμα ιστού. Η διαδικασία διαχωρίζει τις φυσικές πρωτεΐνες προσδιορίζοντας τα μήκη των πολυπεπτιδίων χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης. Οι ίδιες οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρονται σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και διερευνώνται από αντισώματα.
Το πρώτο μέρος του πρωτοκόλλου western blot ξεκινά με τη συλλογή ιστού. Αυτά τα δείγματα συλλέγονται είτε από ζωντανό ιστό είτε από κυτταρική καλλιέργεια. Ο ιστός διασπάται και διάφοροι αναστολείς όπως πρωτεάση ή φωσφατάση εισάγονται για να εμποδίσουν τα ένζυμα να εκτελέσουν την πέψη. Αυτό το τμήμα του πρωτοκόλλου χρησιμοποιείται συνήθως σε χαμηλές θερμοκρασίες για τη διατήρηση των ιστών.
Η διαδικασία ηλεκτροφόρησης γέλης είναι το επόμενο βήμα στο πρωτόκολλο western blot. Σε αυτό το τμήμα, οι πρωτεΐνες αναγνωρίζονται από διάφορους παράγοντες όπως το μοριακό βάρος ή το ηλεκτρικό φορτίο. Αυτή η διαδικασία ολοκληρώνεται συνήθως με τη χρήση πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου με ρυθμιστικό διάλυμα δωδεκυλοθειικού νατρίου. Βασικά, οι πρωτεΐνες φορτίζονται αρνητικά και κινούνται προς ένα θετικά φορτισμένο ηλεκτρόδιο μέσα στο πήκτωμα.
Η μεταφορά των πρωτεϊνών είναι το επόμενο μέρος της συνολικής διαδικασίας western blot. Μια μεμβράνη τοποθετείται στην κορυφή της γέλης, ακολουθούμενη από διηθητικό χαρτί. Καθώς χορηγείται ηλεκτρικό ρεύμα, οι πρωτεΐνες έλκονται στη μεμβράνη. Αυτό αναφέρεται ως το πραγματικό τμήμα «blotting» της ανάλυσης. Οι μεμβράνες είναι ιδιαίτερα εύθραυστες και εύκολα επιρρεπείς σε ζημιές.
Η σωστή ροή του πρωτοκόλλου western blot απαιτεί το βήμα που είναι γνωστό ως δέσμευση. Προκειμένου να αποφευχθεί η μόλυνση των ίδιων των πρωτεϊνών από τα αντισώματα που πρέπει να προστεθούν, πρέπει να εφαρμοστεί ένα είδος θωράκισης. Ο πιο συνηθισμένος τύπος μπλοκαρίσματος χρησιμοποιεί ξηρό γάλα χωρίς λιπαρά και απορρυπαντικό. Αυτό συνδέεται με τα ανοιχτά σημεία στη μεμβράνη και επιτρέπει σαφέστερα αποτελέσματα όταν προστίθεται το αντίσωμα.
Η ανίχνευση είναι το επόμενο βήμα σύμφωνα με το σωστό πρωτόκολλο. Οι πρωτεΐνες εισάγονται σε αντισώματα που έχουν συνδεθεί με ένα συγκεκριμένο ένζυμο το οποίο θα δώσει στους ερευνητές τις επιθυμητές πληροφορίες. Το αντίσωμα επωάζεται με τη μεμβράνη για 30 λεπτά ή περισσότερο. Στη συνέχεια, η μεμβράνη πλένεται και εισάγεται ένα δευτερεύον αντίσωμα που συνδέεται με το πρώτο. Συχνά, χρησιμοποιείται ένας παράγοντας φωταύγειας για να βοηθήσει τους επιστήμονες στη διαδικασία αναγνώρισης.
Το υλικό πλένεται ξανά για να αφαιρεθούν τυχόν αδέσμευτα αντικείμενα. Η ανάλυση του μεγέθους των χρωματισμένων λωρίδων αποκαλύπτει πληροφορίες σχετικά με την προεξοχή και την έκταση μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης. Αυτό γενικά ολοκληρώνεται μερικές φορές για να διασφαλιστεί η σωστή ανάλυση. Οι επιλογές για ανίχνευση περιλαμβάνουν ακτινογραφίες, χρωματισμό και χημικά.