Czym jest technika hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ?

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ, znana również jako hybrydyzacja fluorescencyjna in situ, jest częściej określana jako FISH. Jest to technika polegająca na użyciu krótkiej nici DNA znakowanej barwnikiem fluorescencyjnym w celu wykrycia nieprawidłowości genetycznych. FISH umożliwia badaczom szybką i dokładną wizualizację chromosomów, części chromosomów lub określonych genów. Jest to często wykorzystywane do określenia prognozy i leczenia niektórych chorób, zwłaszcza nowotworów.

FISH służy do określenia, czy chromosomy mają nieprawidłowości. Może to obejmować delecje chromosomów, rearanżacje lub translokacje, w których dwa chromosomy zamieniły się segmentami. FISH umożliwia również badaczom wizualizację określonych genów. Może określić, czy dany gen jest obecny, gdzie znajduje się na chromosomach i czy występuje wiele kopii. Nazywa się to mapowaniem genów.

Struktura genetyczna osoby zawarta jest w jej DNA, które znajduje się w jądrach wszystkich jej komórek. DNA ma dwie nici, które są do siebie komplementarne. Innymi słowy, mają cząsteczki zwane parami zasad, które dokładnie do siebie pasują. Geny to segmenty DNA, które mają określoną sekwencję par zasad i są zlokalizowane w określonych obszarach chromosomów. Geny są dziedziczone i określają sposób funkcjonowania komórek, ale mogą również ulec mutacji, jeśli zmieni się sekwencja par zasad DNA.

Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ wykorzystuje komplementarną naturę nici DNA. Badacze najpierw tworzą sondę. Jest to krótka, pojedyncza nić DNA, która jest komplementarna do sekwencji genetycznej, której szuka badacz. Sonda jest następnie znakowana lub przyłączana do barwnika fluorescencyjnego.

Komórki z chorej tkanki, takie jak biopsja guza, zwykle tworzą próbkę do badania metodą FISH. Próbka jest podgrzewana w celu denaturacji DNA w jądrach komórek. Oznacza to, że podwójne nici DNA w próbkach komórek rozpadają się, tworząc pojedyncze nici. Swoista sonda FISH jest następnie hybrydyzowana z próbką. Innymi słowy, pojedyncza nić sondy jest wprowadzana i łączy się z komplementarną pojedynczą nicią w zdenaturowanych komórkach próbki.

Za pomocą specjalnego mikroskopu fluorescencyjnego badacz przygląda się próbce. Jeśli określony gen lub chromosom jest obecny w próbkach komórek, pojawi się jako światło fluorescencyjne na ciemniejszym tle. Naukowcy mogą łatwo sprawdzić, czy gen jest obecny, czy nie, a jeśli tak, to ile kopii genu znajduje się w każdej komórce. Jeśli badacz szuka lokalizacji genu, może zobaczyć, w którym miejscu chromosomu się on znajduje. Z FISH nie można używać zwykłego mikroskopu świetlnego, ponieważ barwnik fluorescencyjny emituje bardzo niski poziom światła.

Zastosowanie hybrydyzacji DNA z sondami po raz pierwszy osiągnięto w latach sześćdziesiątych; jednak sondy były oznakowane substancjami radioaktywnymi, a nie fluorescencyjnymi. To miało kilka problemów. Substancje radioaktywne są z natury niestabilne, niebezpieczne i wymagają specjalnych protokołów do utylizacji. Dużo czasu zajmuje również zmierzenie sygnału radioaktywnego emitowanego przez zhybrydyzowaną sondę. Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ pokonuje większość tych przeszkód.

Jeśli badacze wiedzą, jakiego genu szukają, FISH szybko i dokładnie go znajdzie. FISH można również przeprowadzić, nawet jeśli komórki nie dzielą się aktywnie, i dostarcza bardziej szczegółowych informacji o nieprawidłowościach w chromosomach. Bardziej konwencjonalne techniki, takie jak karotypowanie, po prostu informują badaczy o liczbie i wielkości chromosomów w komórce.
Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ ma wady. Ponieważ kluczem do FISH jest znajomość sekwencji par zasad i/lub lokalizacji genu, nie można jej użyć jako ogólnego narzędzia do badań przesiewowych. Jest również droższy niż inne, mniej specyficzne techniki i może nie być dostępny we wszystkich laboratoriach lub szpitalach.

Zalety i wady fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ najlepiej opisać na przykładzie. FISH jest rutynowo stosowany w diagnostyce raka piersi w celu ustalenia, czy pacjentka ma wiele kopii genu zwanego HER2. Zwykle wskazuje to na bardziej agresywną postać raka piersi i że pacjentka powinna otrzymywać pewne leki w ramach leczenia. W tym celu można użyć FISH, ponieważ sekwencja par zasad i lokalizacja w chromosomie genu HER2 są znane. W przeciwieństwie do tego, FISH nie może być używany do określenia, jaki nieznany gen lub geny spowodował raka piersi, ani do ogólnego badania przesiewowego raka piersi.