Un spectrofotometru este unul dintre instrumentele științifice întâlnite în mod obișnuit în multe laboratoare de cercetare și industriale. Spectrofotometrele sunt folosite pentru cercetare în laboratoarele de fizică, biologie moleculară, chimie și biochimie. De obicei, numele se referă la spectroscopie ultraviolet-vizibil (UV-Vis).
Energia luminii depinde de lungimea sa de undă, denumită de obicei lambda. Deși spectrul electromagnetic se extinde pe o gamă uriașă de lungimi de undă, majoritatea laboratoarelor pot măsura doar o mică parte din ele. Spectroscopia UV-Vis măsoară între 200 și 400 de nanometri (nm) pentru măsurătorile cu lumină UV și până la aproximativ 750 nm în spectrul vizibil.
Pentru spectroscopia UV-Vis, probele sunt de obicei conținute și măsurate în recipiente mici numite cuve. Acestea pot fi din plastic dacă sunt utilizate în spectrul vizibil, dar trebuie să fie cuarț sau silice topită dacă sunt utilizate pentru măsurători UV. Există unele mașini care pot utiliza eprubete de sticlă.
Spectroscopia vizibilă este adesea folosită industrial pentru colorimetrie. Folosind această metodă, probele sunt măsurate la mai multe lungimi de undă de la 400-700 nm, iar profilele lor de absorbanță sunt comparate cu un standard. Această tehnică este frecvent utilizată de producătorii de textile și cerneală. Alți utilizatori comerciali ai spectroscopiei UV-Vis includ laboratoarele criminalistice și imprimantele.
În cercetarea biologică și chimică, soluțiile sunt adesea cuantificate prin măsurarea gradului lor de absorbție a luminii la o anumită lungime de undă. O valoare numită coeficient de extincție este utilizată pentru a calcula concentrația compusului. De exemplu, laboratoarele de biologie moleculară folosesc spectrofotometre pentru a măsura concentrațiile probelor de ADN sau ARN. Uneori au o mașină avansată numită spectrofotometru NanoDrop™ care utilizează o fracțiune din cantitatea de probă în comparație cu cea folosită de spectrofotometrele tradiționale.
Pentru ca cuantificarea să fie validă, proba trebuie să respecte Legea Beer-Lambert. Acest lucru necesită ca absorbanța să fie direct proporțională cu lungimea traseului cuvei și cu absorbția compusului. Există tabele cu coeficienții de extincție disponibile pentru mulți, dar nu pentru toți, compuși.
Multe reacții chimice și enzimatice își schimbă culoarea în timp, iar spectrofotometrele sunt foarte utile pentru măsurarea acestor modificări. De exemplu, enzimele polifenol oxidaze care determină brunificarea fructelor oxidează soluțiile de compuși fenolici, schimbând soluțiile limpezi în cele care sunt vizibil colorate. Astfel de reacții pot fi testate prin măsurarea creșterii absorbanței pe măsură ce culoarea se schimbă. În mod ideal, rata de schimbare va fi liniară și se pot calcula rate din aceste date. Un spectrofotometru mai avansat va avea un suport de cuvă cu temperatură controlată pentru a efectua reacțiile la o temperatură precisă ideală pentru enzimă.
Laboratoarele de microbiologie și biologie moleculară folosesc frecvent un spectrofotometru pentru a măsura creșterea culturilor de bacterii. Experimentele de clonare a ADN-ului se fac adesea în bacterii, iar cercetătorii trebuie să măsoare stadiul de creștere a culturii pentru a ști când să efectueze anumite proceduri. Ei măsoară absorbanța, care este cunoscută sub numele de densitate optică (OD), pe un spectrofotometru. Din OD se poate spune dacă bacteriile se împart activ sau dacă încep să moară.
Spectrofotometrele folosesc o sursă de lumină pentru a străluci o serie de lungimi de undă printr-un monocromator. Acest dispozitiv transmite apoi o bandă îngustă de lumină, iar spectrofotometrul compară intensitatea luminii care trece prin eșantion cu cea care trece printr-un compus de referință. De exemplu, dacă un compus este dizolvat în etanol, referința ar fi etanolul. Rezultatul este afișat ca grad de absorbție al diferenței dintre ele. Aceasta indică absorbanța compusului eșantionului.
Motivul acestei absorbanțe este că atât lumina ultravioletă, cât și cea vizibilă au suficientă energie pentru a excita substanțele chimice la niveluri mai mari de energie. Această excitație are ca rezultat o lungime de undă mai mare, care este vizibilă atunci când absorbanța este reprezentată în funcție de lungimea de undă. Diferiți molecule sau compuși anorganici absorb energie la diferite lungimi de undă. Cei cu absorbție maximă în domeniul vizibil sunt văzuți ca fiind colorați de ochiul uman.
Soluțiile de compuși pot fi clare, dar se pot absorbi în intervalul UV. Astfel de compuși au de obicei duble legături sau inele aromatice. Uneori există unul sau mai multe vârfuri detectabile atunci când gradul de absorbție este reprezentat în funcție de lungimea de undă. Dacă da, acest lucru poate ajuta la identificarea unor compuși prin compararea formei parcelei cu cea a parcelelor de referință cunoscute.
Există două tipuri de aparate de spectrofotometre UV-Vis, cu fascicul simplu și cu fascicul dublu. Acestea diferă prin modul în care măsoară intensitatea luminii dintre proba de referință și cea de testare. Mașinile cu fascicul dublu măsoară compusul de referință și testul simultan, în timp ce mașinile cu fascicul unic măsoară înainte și după adăugarea compusului de testat.