Ο προσδιορισμός αλληλουχίας διθειώδους είναι μια μέθοδος στην οποία αναλύονται διαφορετικές περιοχές του DNA χρησιμοποιώντας μεθυλίωση. Η μεθυλίωση είναι η διαδικασία προσθήκης ενός συγκεκριμένου μορίου, που ονομάζεται ομάδα μεθυλίου, σε ένα νουκλεοτίδιο, στην περίπτωση αυτή συνήθως μια κυτοσίνη. Τα ανενεργά νουκλεοτίδια συχνά μεθυλιώνονται, επομένως αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διάφορους σκοπούς, από τον προσδιορισμό ενεργών περιοχών ενός γονιδιώματος έως τον εντοπισμό περιοχών πλούσιων σε γονίδια. Στον προσδιορισμό της αλληλουχίας διθειώδους, οι μεθυλιωμένες κυτοσίνες δεν επηρεάζονται από τη διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας, ενώ οι μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες μετατρέπονται σε ουρακίλη, ένα νουκλεοτίδιο που δεν βρίσκεται συνήθως στο γενετικό υλικό, το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA.)
Αυτή η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη στις αλλαγές στη μεθυλίωση, επομένως μικρές αλλαγές στη δέσμευση μπορούν να δώσουν στους ερευνητές συγκεκριμένες πληροφορίες σχετικά με συγκεκριμένα νουκλεοτίδια. Το όξινο θειώδες νάτριο μετατρέπει την κυτοσίνη σε ουρακίλη, αλλά η μετατροπή συμβαίνει σε ένα περιβάλλον όπου η μεθυλιωμένη κυτοσίνη δεν θα υποστεί αυτή την αλλαγή. Όταν ολοκληρωθεί η αλληλουχία των διθειωδών, το αρχικό DNA έχει μετατραπεί σε ένα σημαντικά διαφορετικό μόριο. Οι κυτοσίνες θα είναι πολύ εξαντλημένες ή δυνητικά απούσες. Εάν εξακολουθεί να βρίσκεται μια κυτοσίνη σε αυτό το μετατρεπόμενο μόριο, αντιπροσωπεύει μια φυσικά μεθυλιωμένη κυτοσίνη στο υπό εξέταση γονιδίωμα.
Όπως όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα, η αλληλουχία διθειώδους έχει μειονεκτήματα. Το σημαντικότερο μειονέκτημά του είναι ότι απαιτεί πολύ υψηλή συγκέντρωση αλατιού για να λειτουργήσει σωστά. Το αλάτι ενθαρρύνει την ανόπτηση του μονόκλωνου DNA στην πιο φυσική διπλή έλικα του και το όξινο θειώδες νάτριο δεν μπορεί πάντα να φτάσει στις κυτοσίνες όταν αποτελούν μέρος του δίκλωνου DNA. Εάν η συγκέντρωση άλατος είναι πολύ υψηλή, ένας αριθμός κυτοσινών μπορεί να μην μετατραπεί σε ουρακίλη, με αποτέλεσμα την ψευδή ταυτοποίηση των μεθυλιωμένων κυτοσινών εντός ενός γονιδιώματος. Μπορεί να είναι απαραίτητοι παράγοντες μετουσίωσης για την ελαχιστοποίηση του αριθμού των ψευδώς θετικών ταυτοποιήσεων.
Μεγάλες ποσότητες γονιδιωματικών δεδομένων δεν είναι απαραίτητες για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των όξινων θειώδους, επομένως η μέθοδος έχει μια χρήσιμη εφαρμογή που αναλύει κλινικά δείγματα. Η αρχική πηγή νουκλεϊκού οξέος δεν έχει σημασία, αλλά η πηγή πρέπει να είναι το DNA. Θεωρητικά, θα μπορούσε να προσδιοριστεί η αλληλουχία του ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, καθώς το μεγαλύτερο μέρος του RNA είναι μονόκλωνο και δεν θα ήταν τόσο ευαίσθητο σε ψευδώς θετικά λόγω αποκλεισμένων νουκλεοτιδίων. Ωστόσο, όταν εφαρμόζεται στην πράξη, η αλληλουχία διθειώδους δεν είναι χρήσιμη για το RNA, επειδή το RNA έχει φυσικά ουρακίλη σε αυτό. Χωρίς κάποιο είδος εξωτερικής σήμανσης ή προσθήκης στο πρωτόκολλο, οι μετατρεπόμενες κυτοσίνες δεν θα μπορούσαν να διακριθούν από τη φυσική ουρακίλη.
Κατά την ανάληψη οποιουδήποτε τύπου μεθοδολογίας αλληλουχίας, η ακρίβεια και η ακρίβεια είναι απαραίτητες. Οι ευαίσθητες μέθοδοι όπως ο προσδιορισμός αλληλουχίας διθειώδους προσφέρουν ένα αξιόπιστο μέσο ανάλυσης αλληλουχίας, το οποίο με τη σειρά του επιτρέπει την ανάλυση γονιδίων και τον εντοπισμό στόχων για φάρμακα και θεραπείες. Αν και αυτή η μέθοδος δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ζωντανούς ανθρώπους, μπορεί να είναι πολύ χρήσιμη μόνο με τα πιο μικροσκοπικά δείγματα ιστών για εργασία.