Η ισοηλεκτρική εστίαση (IEF), που ονομάζεται επίσης ηλεκτροεστίαση, είναι ένα μέσο διαχωρισμού μορίων με βάση τις διαφορές στο ηλεκτρικό τους φορτίο. Είναι ένα είδος ηλεκτροφόρησης, ένα φαινόμενο όπου τα σωματίδια μπορούν να διασκορπιστούν στο ρευστό με την εφαρμογή σταθερού ηλεκτρικού πεδίου. Στα ζωντανά κύτταρα, η ισοηλεκτρική εστίαση συμβαίνει φυσικά, αλλά συχνά αναδημιουργείται στο εργαστήριο χρησιμοποιώντας πρωτεΐνες αιωρούμενες σε ένα πήκτωμα.
Η ικανότητα διαχωρισμού μορίων στην ισοηλεκτρική εστίαση βασίζεται στην κατανόηση του επιπέδου pH των διαφορετικών πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες μπορεί να έχουν pH μεταξύ 1 και 12. Το καθαρό φορτίο μιας πρωτεΐνης θα καθοριστεί από το επίπεδο pH του τοπικού περιβάλλοντος. Για παράδειγμα, μια πρωτεΐνη θα μπορούσε να έχει ουδέτερο, θετικό ή αρνητικό καθαρό φορτίο με βάση το pH του περιβάλλοντος.
Το καθαρό φορτίο οποιασδήποτε πρωτεΐνης είναι το συνολικό άθροισμα των θετικών και αρνητικών φορτίων της. Αυτό καθορίζεται από το εάν οι αμινοαλυσίδες που συνθέτουν την πρωτεΐνη είναι όξινες ή βασικές. Όταν υπάρχουν περισσότερες όξινες ομάδες από τις βασικές ομάδες, το pH που προκύπτει θα είναι χαμηλό ή όξινο. Όταν υπάρχουν περισσότερες βασικές ομάδες από τις όξινες, το pH που προκύπτει θα είναι υψηλό ή βασικό. Οι περισσότερες πρωτεΐνες θα έχουν pH 3-12, με μεγάλη συγκέντρωση στην περιοχή 4-7.
Οι πρωτεΐνες είναι θετικά φορτισμένες όταν βρίσκονται σε διάλυμα που έχει τιμή pH χαμηλότερη από αυτή της ίδιας της πρωτεΐνης. Θα έχουν αρνητικό φορτίο όταν η τιμή pH του διαλύματος έχει τιμή pH μεγαλύτερη από το δικό τους pH. Επομένως, το επίπεδο pH της πρωτεΐνης ονομάζεται ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης. Η ισοηλεκτρική εστίαση συμβαίνει όταν το περιβάλλον της πρωτεΐνης χειρίζεται χρησιμοποιώντας ηλεκτρικό πεδίο.
Όταν ένα ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόζεται στο περιβάλλον της πρωτεΐνης, θα επηρεάσει τον τρόπο συμπεριφοράς των σωματιδίων στην πρωτεΐνη. Αυτό σημαίνει ότι όταν η πρωτεΐνη υποβάλλεται σε περιβάλλον που βρίσκεται στο ίδιο επίπεδο pH με την ίδια, τα σωματίδια της πρωτεΐνης δεν θα κινηθούν. Όταν, ωστόσο, η πρωτεΐνη υποβάλλεται σε περιβάλλον που έχει χαμηλότερο pH από την ίδια, τα σωματίδια θα κινηθούν προς την κάθοδο. Εάν το περιβάλλον της πρωτεΐνης έχει υψηλότερο pH από το δικό του, τα σωματίδια θα κινηθούν προς την άνοδο. Η ισοηλεκτρική εστίαση απαιτεί χειρισμό του περιβάλλοντος της πρωτεΐνης έτσι ώστε τα σωματίδια της να κινούνται προς την επιθυμητή κατεύθυνση.