Różnice między masłem a margaryną są czasami określane jako nominalne, na ogół przez zwolenników margaryny, lub znacząco różne, jak donoszą eksperci zajmujący się masłem lub zdrowiem. W Internecie krąży kilka artykułów o wątpliwej autentyczności, które twierdzą nawet, że tylko jedna cząsteczka margaryny stanie się plastyczna. Najbardziej podstawowa różnica między tymi dwiema substancjami polega jednak na tym, że masło pochodzi z tłuszczu zwierzęcego, podczas gdy margaryna pochodzi z uwodornionych olejów roślinnych.
Masło jest znacznie starszym produktem spożywczym niż margaryna. Masło jest produkowane z tłustej śmietanki mleka krowiego, chociaż można stosować inne mleka zwierzęce. Cząsteczki tłuszczu są zwykle utrzymywane w śmietanie w zawiesinie, ale ciągłe mieszanie w ubijaniu masła powoduje, że cząsteczki tłuszczu przywierają do siebie i ostatecznie wypadają ze śmietanki jako gęsta masa masła. Do surowego masła często dodaje się sól, ale nie jest to bezwzględnie konieczne. Ubite masło składa się prawie w całości z tłuszczów nasyconych wraz ze znaczną ilością naturalnego cholesterolu.
Z drugiej strony margaryna jest wytworzonym produktem spożywczym zaprojektowanym specjalnie jako substytut masła w 1869 roku. Wczesne produkty margaryny wykorzystywały jako składnik tłuszcz wołowy, ale większość receptur margaryny została zmieniona na oleje roślinne na początku XX wieku. Normalnie płynny olej roślinny zestala się w procesie, w którym przez mieszaninę przepływają pęcherzyki gazowego wodoru. Rezultatem jest solidny substytut masła bez cholesterolu i z niewielką ilością tłuszczów nasyconych. Margaryna zawiera jednak wielonienasycone i trans kwasy tłuszczowe, które wielu ekspertów w dziedzinie zdrowia uważa za niezdrowe dla ludzi z powodu ich tendencji do zatykania tętnic.
Masło i margaryna różnią się również okresem przydatności do spożycia. Masło należy przechowywać w lodówce, aby pozostało świeże przez kilka dni. Margaryna powinna być przechowywana w lodówce, aby zachować stałą formę między użyciami, ale może pozostać stabilna znacznie dłużej niż masło. Masło, podobnie jak wiele innych produktów spożywczych na bazie mleka, może ulec zepsuciu lub zjełczeniu bez odpowiedniego przechowywania i chłodzenia. Masło i margaryna mogą być używane w przepisach, ale masło wydaje się być domyślnym wyborem profesjonalnych szefów kuchni, podczas gdy margaryna jest preferowana przez bardziej nieformalnych kucharzy. Masło jest często droższe niż margaryna, a różnica w smaku lub konsystencji między masłem a margaryną może być bardzo subtelna, w zależności od jakości użytych marek.