Ο Alexander Fleming, ένας Σκωτσέζος βακτηριολόγος στο Λονδίνο, ανακάλυψε κατά λάθος την πενικιλίνη όταν προσπαθούσε να μελετήσει το βακτήριο Staphylococcus το 1928. Έκανε πειράματα με τα βακτήρια στο εργαστήριό του στο νοσοκομείο St. ένα ανοιχτό παράθυρο. Όταν επέστρεψε στο πείραμα, διαπίστωσε ότι κάποια μούχλα μπήκε μέσα από το ανοιχτό παράθυρο στο πιάτο, μολύνοντας τα βακτήρια.
Αντί να πετάξει το χαλασμένο πείραμά του, ο Φλέμινγκ το κοίταξε προσεκτικά στο μικροσκόπιό του. Παραδόξως, είδε όχι μόνο τη μούχλα να αναπτύσσεται στα βακτήρια, αλλά μια καθαρή ζώνη γύρω από τη μούχλα. Η μούχλα Penicillium, ο πρόδρομος της πενικιλίνης, διέλυε τα θανατηφόρα βακτήρια του σταφυλόκοκκου.
Ο Fleming ήταν αρχικά αισιόδοξος ότι η πενικιλίνη θα ήταν χρήσιμη ως αντιβακτηριδιακός παράγοντας, καθώς ήταν ασφαλής για τον ανθρώπινο οργανισμό, αλλά και ισχυρή. Αργότερα, το 1931, άλλαξε γνώμη και αποφάσισε ότι δεν θα διαρκούσε στους ανθρώπους για όσο διάστημα χρειαζόταν για να σκοτωθούν τα επιβλαβή βακτήρια και σταμάτησε να το μελετά. Το 1934, ξεκίνησε άλλα λίγα χρόνια κλινικών δοκιμών και προσπάθησε να βρει κάποιον άλλο για να το εξαγνίσει.
Ερευνητές στο Πανεπιστήμιο της Οξφόρδης στην Αγγλία, συμπεριλαμβανομένων των Howard Florey, Ernst Chain και Norman Heatley, πειραματίστηκαν με την ανακάλυψη του Fleming. Απέδειξαν ότι η πενικιλίνη θα ήταν και αβλαβής και αποτελεσματική στα ποντίκια, αλλά δεν είχε ακόμη τον όγκο που απαιτείται για τη θεραπεία των ανθρώπων. Ο Orvan Hess και ο John Bumstead ήταν οι πρώτοι άνθρωποι που το χρησιμοποίησαν για να θεραπεύσουν με επιτυχία έναν ασθενή.
Η πενικιλίνη έσωσε τις ζωές πολλών στρατιωτών στον Β’ Παγκόσμιο Πόλεμο, αλλά η προσφορά ήταν εξαιρετικά περιορισμένη και το φάρμακο απεκκρίνονταν γρήγορα από τον οργανισμό, έτσι οι ασθενείς έπρεπε να λαμβάνουν συχνά δόσεις. Ήταν κοινή πρακτική σε αυτό το σημείο να αποθηκεύονται τα ούρα από ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία, έτσι ώστε η πενικιλίνη να μπορεί να απομονωθεί και να επαναχρησιμοποιηθεί. Ένας άλλος παράγοντας, η προβενεσίδη, βρέθηκε τελικά να παρατείνει τη διάρκεια της πενικιλίνης στο ανθρώπινο σώμα.
Οι Fleming, Florey και Chain τιμήθηκαν με το Νόμπελ Ιατρικής το 1945 για την ανακάλυψη και την ανάπτυξη της πενικιλίνης. Ο Florey ανησυχούσε ανοιχτά για την πιθανότητα μιας πληθυσμιακής έκρηξης ως αποτέλεσμα βελτιώσεων στην υγειονομική περίθαλψη και είπε ότι η δουλειά του με το αντιβιοτικό ήταν περισσότερο ένα ενδιαφέρον επιστημονικό πρόβλημα παρά ένας τρόπος να βοηθήσει τους ανθρώπους. Παραδέχτηκε ότι το γεγονός ότι μπορούσε να βοηθήσει τους ανθρώπους ήταν καλό, αλλά όχι γιατί αρχικά τον ενδιέφερε.
Ο Andrew J. Moyer ανακάλυψε αργότερα πώς να φτιάχνει μεγάλες ποσότητες πενικιλίνης, κατοχυρώνοντας με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας τη διαδικασία και προωθώντας την καταπολέμηση των μολυσματικών ασθενειών. Το 1987, εισήχθη στο National Inventors Hall of Fame για τη διαδικασία δημιουργίας πενικιλίνης σε υψηλή ποσότητα.