Bufnițele joacă un rol important în mitologia multor culturi din întreaga lume. În mitologie, ei pot fi însoțitori ai zeilor, spiritelor rele, observatorilor înțelepți sau întruchiparea forțelor naturale. În multe culturi, bufnițele sunt mesageri ai morții sau asociate în alt mod cu puterile lumii interlope. Această conotație negativă vine din faptul că bufnițele sunt nocturne; animalele care sunt active noaptea au adesea roluri negative în mit și folclor.
Cele mai cunoscute bufnițe din mitologie sunt probabil cele asociate cu Athena, zeița greacă a înțelepciunii și a războiului, zeitatea patronă a orașului Atena. Artiștii au descris-o pe Athena cu o bufniță pe un umăr. Este posibil ca bufnițele să fi fost conectate cu zeița datorită capacității lor de a vedea bine noaptea și a ochilor lor mari, care i-au evocat epitetul „Athena cu ochi strălucitori”. Ca urmare a acestei asocieri, bufnițele continuă să fie simboluri ale înțelepciunii în lumea occidentală. Un gen de bufnițe păstrează numele „Athene”.
Mitologia din alte părți ale lumii oferă adesea bufnițelor un rol mai sinistru. Deși romanii au adoptat multe elemente ale religiei grecești, folclorul roman a prezentat, de asemenea, creaturi periculoase asemănătoare bufniței care puteau suge forța vitală a unui copil. În mod similar, în mitologia arabă, bufnițele erau păsări de rău augur. Legenda spunea că bufnițele urlau peste mormintele bărbaților uciși, iar ouăle lor erau considerate a avea proprietăți supranaturale. Se știe că există sau au existat credințe similare în Africa sub-sahariană, unde bufnițele joacă rolul de vestitoare ale morții sau aducătoare de ghinion.
În America de Sud și Centrală, bufnițele sunt din nou conectate cu moartea și lumea interlopă. În mitologia mayașă, Xibalba, „locul fricii”, este condus de doi zei ai morții, Hun-Came („O singură moarte”) și Vucub-Came („Șapte morți”). Mesagerii lor sunt patru spirite care iau forma de bufnițe. În mod similar, zeul aztec Mictlantecuhtli, zeul morților, apare ca un schelet purtând o cască din pene de bufniță.
Națiunile native americane din America de Nord au avut o mare varietate de roluri diferite pentru bufnițe în mitologia lor. În unele culturi, bufnița a jucat rolul unui mesager din lumea interlopă, în timp ce în altele, cum ar fi Sioux, a fost un gardian care a protejat intrarea în viața de apoi. Națiunea Passamaquoddy a spus o poveste în care pasărea a fost un spirit de ajutor care a oferit oamenilor daruri magice.