Gelul de agaroză este o substanță care este utilizată în biochimie și biotehnologie pentru electroforeza pe gel și cromatografia de excludere a mărimii, care sunt metode de sortare a moleculelor mari după dimensiunea și sarcina lor electrică. Aceste procese folosesc agaroza pentru a separa și analiza proteinele și ADN-ul. Este foarte potrivit pentru aceste aplicații datorită structurii sale moleculare, care permite moleculelor de diferite dimensiuni să se deplaseze prin el la viteze diferite. Materialul este obținut din diverse tipuri de alge marine și se găsește de obicei în laboratoare sub formă de pulbere. Pentru a face un mediu adecvat pentru un test dat, pulberea este adăugată în apă la concentrația corespunzătoare, se fierbe și apoi se lasă să se răcească într-un gel.
Fabricare
Agaroza este extrasă sub formă de agar din mai multe specii de alge marine roșii, sau alge marine, găsite în California și Asia de Est. Agar, un termen derivat din cuvântul malaysian agar-agar, care înseamnă jeleu, este de obicei obținut din tipurile de alge marine Gelidium. Este compus din două substanțe diferite, cunoscute sub numele de agaroză și agaropectină, și oferă sprijin pereților celulari din interiorul algelor marine. Când este îndepărtat, agar-ul poate fi folosit ca un agent de îngroșare alimentară, la fel ca gelatina, sau ca laxativ. Dacă este purificat, poate fi folosit ca mediu pentru creșterea bacteriilor, ciupercilor sau a altor microorganisme.
Este destul de ușor să separați agaroza de agaropectină în agar, deoarece moleculele de agaroză se leagă puternic între ele, în timp ce agaropectina se gelifică slab. Există mai multe metode pentru a realiza izolarea agarozei. Într-o metodă, caragenanul, o altă moleculă găsită în algele marine roșii și o sare sunt adăugate în agar. Acest lucru face ca agaropectina să precipite sau să formeze un solid care poate fi îndepărtat din soluția de agar. O altă metodă adaugă enzima pectinaza, o substanță chimică care descompune agaropectina, permițându-i să se dizolve în apă.
Electroforeză cu gel
Gelul de agaroză este cel mai frecvent asociat cu electroforeza. În această procedură, oamenii de știință aplică un câmp electric pe o placă a materialului care conține fragmente de ADN, ARN sau proteine dizolvate. Acest lucru face ca aceste molecule mari să se miște din cauza sarcinilor lor electrice: tipurile încărcate pozitiv se vor deplasa spre partea negativă și invers. Fragmentele de ADN și ARN au o sarcină negativă și astfel se vor deplasa spre capătul pozitiv, în timp ce fragmentele de proteine pot fi fie negative, fie pozitive.
Viteza cu care se mișcă moleculele depinde de dimensiunea lor și de cât de multă sarcină au. Gelul de agaroză este structurat în așa fel încât să formeze un fel de plasă, cu găuri prin care pot călători alte molecule. Cei mai mici le este mai ușor să treacă prin găuri și astfel călătoresc mai repede. Printre moleculele mai mari, forma joacă, de asemenea, un rol, prin faptul că cele mai compacte trec mai ușor. Tehnica este utilizată atât pentru a analiza probe, cât și pentru a izola anumite secvențe de ADN pentru utilizare în aplicații biotehnologice.
Înainte de electroforeză, o probă de ADN ar fi tratată cu enzime speciale care taie moleculele lungi, asemănătoare catenei în locuri specifice, făcând fragmente mai mici. Gelul de agaroză se prepară prin dizolvarea pulberii într-o soluție tampon, care rezistă la schimbările de pH – aciditate/alcalinitate – care altfel ar putea rezulta din efecte electrochimice. Sunt utilizate cantități diferite de pulbere pentru diferite game de molecule, dar de obicei concentrația este între 0.7 și 1.2%. Un colorant fluorescent numit bromură de etidio este de obicei adăugat în acest moment, deoarece colorează ADN-ul și îl face ușor vizibil sub lumina ultravioletă. Acest amestec este apoi pus la microunde și lăsat să se întărească.
Probele de ADN sunt introduse în godeuri mici din gel și se aplică un curent electric direct peste el. Molecule de dimensiuni diferite călătoresc prin gel cu viteze diferite, astfel încât după un anumit timp vor apărea în poziții diferite, cu fragmentele mai mici mai departe spre capătul pozitiv. Acest lucru le permite oamenilor de știință să determine dimensiunile fragmentelor și să izoleze diferite secvențe de ADN.
Alte utilizări
Gelul de agaroză este uneori folosit într-o tehnică similară care nu implică electricitate, cunoscută sub numele de cromatografia de excludere a mărimii. În această metodă, o coloană de sticlă este împachetată cu margele făcute din gel și se toarnă o soluție care conține molecule de diferite dimensiuni. Spre deosebire de electroforeză, moleculele mai mari se deplasează mai repede în jos pe coloană pentru a ieși în partea de jos, în timp ce progresul a celor mai mici este încetinit în margele. Acest lucru se datorează faptului că moleculele mici tind să fie absorbite în porii din gel, în timp ce cele mai mari sunt prea mari pentru a intra în acești pori și tind în schimb să curgă între margele. Tipul de gel și concentrația pot fi ajustate pentru a se potrivi cu dimensiunile moleculei care trebuie separate.