Hibridizarea fluorescentă in situ, cunoscută și sub denumirea de hibridizare fluorescentă in situ, este denumită mai frecvent FISH. Este o tehnică care implică utilizarea unui fir scurt de ADN marcat cu un colorant fluorescent pentru a detecta anomalii genetice. FISH permite investigatorilor să vizualizeze cromozomii, părțile cromozomilor sau anumite gene rapid și precis. Acesta este adesea folosit pentru a determina prognosticul și tratamentul pentru anumite boli, în special cancere.
FISH este folosit pentru a determina dacă cromozomii prezintă anomalii. Aceasta poate include deleții cromozomiale, rearanjamente sau translocații, în care doi cromozomi au segmente comutate. FISH permite, de asemenea, investigatorilor să vizualizeze gene specifice. Poate determina dacă o anumită genă este prezentă, unde este localizată pe cromozomi și dacă sunt prezente mai multe copii. Aceasta se numește cartografiere genică.
Machiajul genetic al unei persoane este conținut în ADN-ul său, care este situat în nucleele tuturor celulelor sale. ADN-ul are două catene care sunt complementare una pentru cealaltă. Cu alte cuvinte, au molecule numite perechi de baze care se potrivesc exact împreună. Genele sunt segmente de ADN care au o anumită secvență de perechi de baze și sunt localizate pe zone specifice ale cromozomilor. Genele sunt moștenite și determină modul în care celulele funcționează, dar pot deveni și mutante dacă secvența perechilor de baze ADN se modifică.
Tehnica de hibridizare fluorescentă in situ profită de natura complementară a catenelor de ADN. Anchetatorii creează mai întâi o sondă. Aceasta este o catenă scurtă, unică de ADN, care este complementară secvenței genetice pe care o caută investigatorul. Sonda este apoi marcată sau atașată la un colorant fluorescent.
Celulele din țesutul bolnav, cum ar fi o biopsie tumorală, alcătuiesc de obicei proba care urmează să fie examinată de FISH. Proba este încălzită pentru a denatura ADN-ul din nucleele celulelor. Aceasta înseamnă că catenele duble de ADN din celulele eșantionului se despart pentru a forma catene simple. O sondă FISH specifică este apoi hibridizată cu proba. Cu alte cuvinte, catena unică a sondei este introdusă și fuzionează cu catena sa unică complementară în celulele de probă denaturate.
Folosind un microscop fluorescent special, cercetătorul se uită la eșantion. Dacă gena specifică sau cromozomul este prezent în celulele eșantionului, va apărea ca o lumină fluorescentă pe un fundal mai întunecat. Cercetătorii pot vedea cu ușurință dacă gena este prezentă sau nu și, dacă este, câte copii ale genei sunt în fiecare celulă. Dacă cercetătorul caută locația unei gene, el sau ea poate vedea unde se află aceasta pe cromozom. Un microscop cu lumină obișnuit nu poate fi folosit cu FISH, deoarece colorantul fluorescent emite un nivel foarte scăzut de lumină.
Utilizarea hibridizării ADN cu sonde a fost realizată pentru prima dată în anii 1960; cu toate acestea, sondele au fost etichetate cu substanțe radioactive mai degrabă decât cu cele fluorescente. Acest lucru a avut mai multe probleme. Substanțele radioactive sunt în mod inerent instabile, periculoase și necesită protocoale speciale pentru eliminare. De asemenea, este nevoie de mult timp pentru a măsura semnalul radioactiv emis de sonda hibridizată. Tehnica de hibridizare fluorescentă in situ depășește majoritatea acestor obstacole.
Dacă anchetatorii știu ce genă caută, FISH este rapid și precis în găsirea acesteia. FISH poate fi, de asemenea, efectuat chiar dacă celulele nu se divid activ și oferă informații mai specifice despre anomaliile cromozomilor. Tehnicile mai convenționale, cum ar fi karotiparea, pur și simplu spun investigatorilor numărul și dimensiunea cromozomilor dintr-o celulă.
Hibridizarea fluorescentă in situ are dezavantaje. Deoarece cheia FISH este cunoașterea secvenței perechii de baze și/sau a locației unei gene, aceasta nu poate fi folosită ca instrument general de screening. De asemenea, este mai scump decât alte tehnici, mai puțin specifice și este posibil să nu fie disponibil în toate laboratoarele sau spitalele.
Avantajele și dezavantajele hibridizării fluorescente in situ sunt cel mai bine descrise prin exemple. FISH este utilizat în mod obișnuit în diagnosticul cancerului de sân pentru a determina dacă un pacient are mai multe copii ale unei gene numite HER2. Acest lucru indică de obicei o formă mai agresivă de cancer de sân și că pacienta ar trebui să primească anumite medicamente ca parte a tratamentului. FISH poate fi utilizat pentru aceasta deoarece secvența perechii de baze și locația cromozomială a genei HER2 sunt cunoscute. În schimb, FISH nu poate fi utilizat pentru a determina ce genă sau gene necunoscute au cauzat cancerul de sân sau pentru a detecta cancerul de sân în general.