Οι πρωτεΐνες αποτελούνται από αλυσίδες αμινοξέων, καθένα από τα οποία έχει διαφορετικές τιμές pH. Το συνολικό pH της πρωτεΐνης αποτελείται από το μείγμα των τιμών pH των μεμονωμένων αμινοξέων καθώς σχηματίζουν ιόντα στο συγκεκριμένο διάλυμα στο οποίο διαλύονται. Το ισοηλεκτρικό σημείο (pI) μιας πρωτεΐνης είναι το pH στο οποίο αυτή η πρωτεΐνη δεν έχει καθαρό φορτίο. Αυτή η ιδιότητα μπορεί να αξιοποιηθεί για να διαχωριστεί η πρωτεΐνη με το γνωστό pI από άλλες πρωτεΐνες σε ένα ετερογενές μείγμα.
Τα αμινοξέα έχουν μια αμινοτελική ομάδα που είναι βασική, με υψηλό pH. Το άλλο άκρο του αμινοξέος είναι το καρβοξυλικό τερματικό που είναι όξινο, με χαμηλό pH. Σε διαφορετικές τιμές pH, τα αμινοξέα στις πρωτεΐνες θα ποικίλλουν ως προς τα φορτία τους. Οι πρωτεΐνες κάτω από το ισοηλεκτρικό τους σημείο έχουν θετικό φορτίο. Αντίθετα, αυτά που βρίσκονται πάνω από αυτό το σημείο έχουν αρνητικό φορτίο.
Για να αξιοποιηθεί η γνώση του ισοηλεκτρικού σημείου για τον καθαρισμό της πρωτεΐνης, ένα μείγμα πρωτεϊνών υποβάλλεται σε ηλεκτρικό πεδίο. Αυτό γίνεται συνήθως σε πηκτώματα αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου και είναι γνωστό ως ισοηλεκτρική εστίαση. Μια παλαιότερη τεχνική είναι η εκτέλεση της διαδικασίας σε μεγαλύτερη κλίμακα σε μια γυάλινη στήλη χρησιμοποιώντας ένα διάλυμα σακχαρόζης με ηλεκτρόδια σε κάθε άκρο. Προστίθενται ενώσεις που ονομάζονται αμφολύτες που προκαλούν το σχηματισμό μιας σταθερής βαθμίδας pH. Όταν η γέλη ή η στήλη υποβάλλεται στο ηλεκτρικό ρεύμα, οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν μέχρι να φτάσουν στο ισοηλεκτρικό τους σημείο και στη συνέχεια παραμένουν ακίνητες.
Οι πρωτεΐνες σε πηκτώματα γίνονται γενικά ορατές από μια χρωστική που δεσμεύει τις πρωτεΐνες. Μερικές φορές, εάν μελετώνται ένζυμα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένα υπόστρωμα που δίνει μια έγχρωμη αντίδραση. Συνήθως χρησιμοποιούνται πρότυπα που έχουν πρωτεΐνες γνωστών ισοηλεκτρικών σημείων.
Όταν κάποιος γνωρίζει πού βρίσκεται η επιθυμητή πρωτεΐνη, μια κοινή τεχνική είναι να κόψει την απομονωμένη πρωτεΐνη από το τζελ. Η πρωτεΐνη μπορεί στη συνέχεια να καθαριστεί και να προσδιοριστεί η αλληλουχία της. Μόλις γίνει γνωστή η αλληλουχία, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το σχεδιασμό εκκινητών για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (pcr) και να χρησιμοποιηθεί για την κλωνοποίηση του γονιδίου για την πρωτεΐνη εάν είναι διαθέσιμο κατάλληλο υλικό νουκλεϊκού οξέος.
Η ισοηλεκτρική εστίαση είναι επίσης ένας κοινός τρόπος ανάλυσης στενά συγγενών πρωτεϊνών για να δούμε πόσο διαφορετικές είναι μεταξύ τους. Μια επιπλοκή μπορεί να είναι ότι οι πρωτεΐνες μπορεί να έχουν σάκχαρα συνδεδεμένα με αυτές. Αυτό ονομάζεται γλυκοζυλίωση και μπορεί να επηρεάσει το pI της πρωτεΐνης. Μπορεί να φαίνεται ότι υπάρχουν πολλές πρωτεΐνες με διαφορετικά ισοηλεκτρικά σημεία, ενώ στην πραγματικότητα υπάρχει μόνο μία πρωτεΐνη που έχει διαφοροποιηθεί γλυκοζυλιωμένη. Οι πρωτεΐνες που καθαρίζονται με τυπικές μεθόδους, όπως η χρωματογραφία, μερικές φορές αναλύονται με ισοηλεκτρική εστίαση για να διασφαλιστεί η καθαρότητά τους.