Το ομοεστιακό μικροσκόπιο είναι ένα συγκεκριμένο είδος μικροσκοπίου φθορισμού που χρησιμοποιείται για τη λήψη εικόνων 2D και 3D υψηλής ποιότητας. Με ένα βασικό (ευρείας πεδίου) φθορίζον μικροσκόπιο, φως συγκεκριμένου μήκους κύματος, εκπέμπεται σε ένα δείγμα και το δείγμα απορροφά μέρος αυτού του φωτός και ανακλά το υπόλοιπο σε μεγαλύτερο μήκος κύματος. Το φως μεγαλύτερου μήκους κύματος περνά μέσα από ένα διχρωμικό κάτοπτρο, το οποίο επιτρέπει στο φως μεγαλύτερου μήκους κύματος, αλλά όχι στο αρχικό (μικρότερο) μήκος κύματος να περάσει. Το άτομο που βλέπει το δείγμα βλέπει μόνο το φως που έχει περάσει από τον διχρωμικό καθρέφτη. Τα βασικά μικροσκόπια φθορισμού συλλαμβάνουν φως τόσο εντός όσο και εκτός εστίασης, το οποίο λειτουργεί καλά για μεγάλα δείγματα όπου δεν απαιτείται πολύ υψηλή ανάλυση. Δεν λειτουργεί τόσο καλά για την προβολή λεπτομερειών. Απαιτείται ομοεστιακό μικροσκόπιο για τη λήψη εικόνων φθορισμού υψηλής ανάλυσης.
Το ομοεστιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιεί μια τρύπα καρφίτσας για την απόρριψη φωτός εκτός εστίασης. Αντί το φως να διέρχεται μόνο από έναν διχρωμικό καθρέφτη, το φως περνάει από έναν διχρωμικό καθρέφτη και από μια τρύπα καρφίτσας, πράγμα που σημαίνει ότι το άτομο που βλέπει το δείγμα βλέπει μόνο ένα σημείο του δείγματος. Προκειμένου να προβληθεί ένα ολόκληρο δείγμα, οι κινητοί καθρέφτες σαρώνουν φως σε ένα ορθογώνιο επίπεδο του δείγματος και ένας υπολογιστής συλλέγει το εκπεμπόμενο φως καθώς το δείγμα σαρώνεται. Μια πλήρης σάρωση θα έχει ως αποτέλεσμα μια οπτική τομή ή διατομή του δείγματος. Αυτός ο τύπος μικροσκοπίας ονομάζεται ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ, εν μέρει επειδή χρησιμοποιείται λέιζερ ως πηγή φωτός.
Για τη δημιουργία μιας τρισδιάστατης εικόνας, πραγματοποιούνται πολλές σαρώσεις, δημιουργώντας πολλές «φέτες» του δείγματος και ένας υπολογιστής συνδυάζει κάθε φέτα για να δημιουργήσει μια τρισδιάστατη εικόνα. Το μικροσκόπιο μπορεί να προγραμματιστεί ώστε να μεταβάλλει το διάστημα μεταξύ των κομματιών, ανάλογα με το πόσο καθαρή μια τρισδιάστατη εικόνα θέλει να αποκτήσει ο χρήστης. Το μικροσκόπιο μπορεί επίσης να μεταβάλλει την ταχύτητα με την οποία σαρώνει μια εικόνα, με την αργή σάρωση να δίνει υψηλότερη ανάλυση από τη γρήγορη σάρωση.
Το ομοεστιακό μικροσκόπιο έχει γίνει ένας πολύ συχνά χρησιμοποιούμενος εξοπλισμός σε πολλά εργαστήρια βιοεπιστημών. Είναι ακριβά, και κάπως μεγάλα, και συχνά έχουν δωμάτια αφιερωμένα στη χρήση τους, επειδή το δωμάτιο πρέπει να είναι σκοτεινό για να αποκτήσει μια καλή φθορίζουσα εικόνα. Αν και τα ομοεστιακά μικροσκόπια χρησιμοποιούνται πιο συχνά για την προβολή κυψελών και δομών εντός κυψελών, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη λήψη εικόνας οποιουδήποτε τρισδιάστατου δείγματος φθορισμού και μερικές φορές χρησιμοποιούνται για την προβολή υλικών ημιαγωγών.