Test immunoenzymatyczny (ELISA) to test wykonywany w laboratorium immunologicznym w celu określenia poziomu białka w próbce biologicznej. Wykrywanie ELISA odnosi się do ostatniego etapu testu, w którym klarowny roztwór lub substrat jest dodawany do plastikowej płytki zawierającej związane przeciwciało znakowane enzymatycznie. Enzym rozszczepia substrat i następuje zmiana koloru. Absorbancję światła końcowego zabarwionego roztworu mierzy się następnie na czytniku płytek ELISA lub spektrofotometrze.
Istnieją różne rodzaje testów ELISA, z których dwa najczęstsze to pośredni ELISA i ELISA wychwytywania lub kanapka. Pośredni test ELISA służy do wykrywania białka, zwanego przeciwciałem, w surowicy pacjenta. Przykładem pośredniego testu ELISA jest test na ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) stosowany do wykrywania przeciwciał przeciwko HIV. Test kanapkowy ELISA wykrywa białko lub antygen, wychwytując je między dwoma przeciwciałami. Wykrywanie hormonu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), który jest podwyższony w czasie ciąży, odbywa się za pomocą testu kanapkowego ELISA.
Oba testy mają etap wykrywania ELISA na końcu testu. Ten etap obejmuje dodanie przeciwciała, do którego dołączona jest cząsteczka enzymu. Po dodaniu przeciwciała znakowanego enzymem dodaje się bezbarwny roztwór zawierający cząsteczkę substratu specyficzną dla tego enzymu. Enzym rozszczepia cząsteczkę substratu, a roztwór zmienia kolor w zależności od zastosowanej kombinacji. Oznaczenie ilości przeciwciała lub antygenu w próbce pacjenta odbywa się poprzez pomiar intensywności zmiany koloru.
Dostępnych jest kilka kombinacji substratów enzymatycznych do zastosowania w etapie wykrywania ELISA. Najpowszechniejszym enzymem jest peroksydaza chrzanowa (HRP), która może rozszczepiać cząsteczki substratu, między innymi, dichlorowodorku orto-fenylenodiaminy (OPD) i tetrametylobenzydyny (TMB). Rozszczepienie zarówno OPD, jak i TMB daje żółty kolor, a gęstość optyczną lub absorbancję światła tych substratów mierzy się za pomocą czytnika płytek ELISA. Absorbancję światła OPD mierzy się przy długości fali 490 nanometrów (nm), podczas gdy TMB mierzy się przy 450 nm.
Innym powszechnym enzymem stosowanym w etapie wykrywania ELISA jest fosfataza alkaliczna. Enzym ten jest używany z substratem fosforanem p-nitrofenylu (PNPP), a także wytwarza żółty roztwór. PNPP pochłania światło o długości fali 405 nm.
Wybór kombinacji substratów enzymatycznych jest zwykle oparty na tym, jakie przeciwciała znakowane enzymatycznie są dostępne w handlu, a także jaki sprzęt będzie używany do pomiaru absorbancji światła. Wiele kombinacji dostępnych do wykrywania ELISA sprawia, że test ELISA jest bardzo wszechstronny. Jest ważnym narzędziem w testach na choroby i laboratoriach badawczych.