Ο υβριδισμός φθορισμού in situ, γνωστός και ως υβριδισμός φθορισμού in situ, αναφέρεται πιο συχνά ως FISH. Είναι μια τεχνική που περιλαμβάνει τη χρήση ενός κοντού κλώνου DNA σημασμένου με φθορίζουσα χρωστική για την ανίχνευση γενετικών ανωμαλιών. Το FISH επιτρέπει στους ερευνητές να οπτικοποιήσουν γρήγορα και με ακρίβεια χρωμοσώματα, μέρη χρωμοσωμάτων ή συγκεκριμένα γονίδια. Αυτό χρησιμοποιείται συχνά για τον προσδιορισμό της πρόγνωσης και της θεραπείας ορισμένων ασθενειών, ιδιαίτερα των καρκίνων.
Το FISH χρησιμοποιείται για να προσδιοριστεί εάν τα χρωμοσώματα έχουν ανωμαλίες. Αυτό μπορεί να περιλαμβάνει χρωμοσωμικές διαγραφές, αναδιατάξεις ή μετατοπίσεις, στις οποίες δύο χρωμοσώματα έχουν εναλλασσόμενα τμήματα. Το FISH επιτρέπει επίσης στους ερευνητές να οπτικοποιήσουν συγκεκριμένα γονίδια. Μπορεί να καθορίσει εάν υπάρχει ένα συγκεκριμένο γονίδιο, πού βρίσκεται στα χρωμοσώματα και αν υπάρχουν πολλαπλά αντίγραφα. Αυτό ονομάζεται γονιδιακή χαρτογράφηση.
Η γενετική σύνθεση ενός ατόμου περιέχεται στο DNA του, το οποίο βρίσκεται στους πυρήνες όλων των κυττάρων του. Το DNA έχει δύο κλώνους που είναι συμπληρωματικές μεταξύ τους. Με άλλα λόγια, έχουν μόρια που ονομάζονται ζεύγη βάσεων που ταιριάζουν ακριβώς μεταξύ τους. Τα γονίδια είναι τμήματα του DNA που έχουν μια συγκεκριμένη αλληλουχία ζευγών βάσεων και βρίσκονται σε συγκεκριμένες περιοχές των χρωμοσωμάτων. Τα γονίδια κληρονομούνται και καθορίζουν τον τρόπο λειτουργίας των κυττάρων, αλλά μπορούν επίσης να μεταλλαχθούν εάν αλλάξει η αλληλουχία των ζευγών βάσεων DNA.
Η τεχνική in situ υβριδισμού φθορισμού εκμεταλλεύεται τη συμπληρωματική φύση των κλώνων DNA. Οι ερευνητές δημιουργούν πρώτα μια έρευνα. Αυτή είναι μια σύντομη, μονή αλυσίδα DNA που είναι συμπληρωματική με τη γενετική αλληλουχία που αναζητά ο ερευνητής. Ο ανιχνευτής στη συνέχεια επισημαίνεται ή προσαρτάται σε μια φθορίζουσα βαφή.
Κύτταρα από άρρωστο ιστό, όπως μια βιοψία όγκου, συνήθως αποτελούν το δείγμα που θα εξεταστεί από το FISH. Το δείγμα θερμαίνεται για να μετουσιωθεί το DNA στους πυρήνες των κυττάρων. Αυτό σημαίνει ότι οι διπλοί κλώνοι του DNA στα κύτταρα του δείγματος διασπώνται για να σχηματίσουν μονούς κλώνους. Ένας συγκεκριμένος ανιχνευτής FISH στη συνέχεια υβριδίζεται με το δείγμα. Με άλλα λόγια, ο μονόκλωνος του ανιχνευτή εισάγεται και συγχωνεύεται με τον συμπληρωματικό μονό κλώνο του στα μετουσιωμένα κύτταρα δείγματος.
Χρησιμοποιώντας ένα ειδικό μικροσκόπιο φθορισμού, ο ερευνητής εξετάζει το δείγμα. Εάν το συγκεκριμένο γονίδιο ή χρωμόσωμα υπάρχει στα κύτταρα του δείγματος, θα εμφανιστεί ως φως φθορισμού σε πιο σκούρο φόντο. Οι ερευνητές μπορούν εύκολα να δουν αν το γονίδιο υπάρχει ή όχι, και αν υπάρχει, πόσα αντίγραφα του γονιδίου υπάρχουν σε κάθε κύτταρο. Εάν ο ερευνητής αναζητά τη θέση ενός γονιδίου, μπορεί να δει πού βρίσκεται στο χρωμόσωμα. Ένα κανονικό μικροσκόπιο φωτός δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με το FISH, επειδή η φθορίζουσα βαφή εκπέμπει πολύ χαμηλό επίπεδο φωτός.
Η χρήση του υβριδισμού DNA με ανιχνευτές επιτεύχθηκε για πρώτη φορά στη δεκαετία του 1960. Ωστόσο, οι ανιχνευτές επισημάνθηκαν με ραδιενεργές ουσίες και όχι με φθορίζουσες ουσίες. Αυτό είχε αρκετά προβλήματα. Οι ραδιενεργές ουσίες είναι εγγενώς ασταθείς, επικίνδυνες και απαιτούν ειδικά πρωτόκολλα για την απόρριψή τους. Χρειάζεται επίσης πολύς χρόνος για τη μέτρηση του ραδιενεργού σήματος που εκπέμπεται από τον υβριδοποιημένο ανιχνευτή. Η τεχνική in situ υβριδισμού φθορισμού ξεπερνά τα περισσότερα από αυτά τα εμπόδια.
Εάν οι ερευνητές γνωρίζουν ποιο γονίδιο αναζητούν, το FISH είναι γρήγορο και ακριβές στο να το βρει. Το FISH μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί ακόμη και αν τα κύτταρα δεν διαιρούνται ενεργά και παρέχει πιο συγκεκριμένες πληροφορίες σχετικά με ανωμαλίες στα χρωμοσώματα. Οι πιο συμβατικές τεχνικές, όπως η καροτύπανση, απλώς λένε στους ερευνητές τον αριθμό και το μέγεθος των χρωμοσωμάτων μέσα σε ένα κύτταρο.
Ο υβριδισμός φθορισμού in situ έχει μειονεκτήματα. Δεδομένου ότι το κλειδί για το FISH είναι η γνώση της αλληλουχίας του ζεύγους βάσεων ή/και της θέσης ενός γονιδίου, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως γενικό εργαλείο διαλογής. Είναι επίσης πιο ακριβό από άλλες, λιγότερο συγκεκριμένες τεχνικές και μπορεί να μην είναι διαθέσιμο σε όλα τα εργαστήρια ή τα νοσοκομεία.
Τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα του υβριδισμού φθορισμού in situ περιγράφονται καλύτερα με παράδειγμα. Το FISH χρησιμοποιείται συνήθως στη διάγνωση του καρκίνου του μαστού για να προσδιοριστεί εάν ένας ασθενής έχει πολλαπλά αντίγραφα ενός γονιδίου που ονομάζεται HER2. Αυτό συνήθως υποδηλώνει μια πιο επιθετική μορφή καρκίνου του μαστού και ότι ο ασθενής πρέπει να λάβει ορισμένα φάρμακα ως μέρος της θεραπείας του. Το FISH μπορεί να χρησιμοποιηθεί για αυτό επειδή η αλληλουχία του ζεύγους βάσεων και η χρωμοσωμική θέση του γονιδίου HER2 είναι γνωστές. Αντίθετα, το FISH δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί ποιο άγνωστο γονίδιο ή γονίδια έχουν προκαλέσει τον καρκίνο του μαστού ή για τον έλεγχο για καρκίνο του μαστού γενικά.